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　　凍存試劑、樣品可以室溫或37℃水浴解凍嗎?

　　凍存試劑或樣品的解凍，如果時(shí)間比較充裕，建議在冰浴或冰水浴上緩慢解凍。如果時(shí)間比較著急，大多數(shù)凍存的試劑或樣品是可 以在室溫或37℃水浴解凍，但都必須特別小心，必須邊觀察、邊輕輕晃動(dòng)、邊融解。待 部分溶解后即需從水浴中取出，確保溶解過(guò)程中試劑或樣品還是接近0℃的。如果該試劑或樣品在0℃不會(huì)結(jié)凍，解凍后可以置于冰浴或冰水浴。

　　為了使生物樣品在一定的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，人們按不同需求將樣品保存在4℃，-20℃，-80℃ 或溫度更低的冰箱中，或者保存在液氮中。本生本文談?wù)勆飿悠返蜏乇４嬗绕涫莾龃鏁r(shí)需要注意的一些問(wèn)題。

　　1. 長(zhǎng)期保存的組織樣品要盡快凍存

　　樣品貯存的溫度對(duì)有效保存時(shí)間的影響很大。選擇合適的貯存方式和貯存溫度很重要。但為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的客觀性，研究者也要充分注意樣品在貯存或固定前的處置時(shí)間和方式。樣品從開(kāi)始收獲到固定或低溫保存前這段時(shí)間，仍有一些生化過(guò)程在較快地進(jìn)行。這些生化反應(yīng)的速度直到樣品被固定或者低溫保存時(shí)才顯著降低。這一段時(shí)間越短越好。

　　2. 樣品凍存的優(yōu)缺點(diǎn)

　　相比于FFPE樣品，凍存組織的DNA 和RNA的得率高，片段長(zhǎng)，質(zhì)量好。可用于基因芯片和新一代測(cè)序等高通量基因組學(xué)檢測(cè)。不同于FFPE樣品，凍存組織內(nèi)的蛋白質(zhì)(如酶類(lèi))仍然保持生物活性，可用于某些檢測(cè)。但對(duì)凍存樣品，需要注意一些問(wèn)題。凍存組織的形態(tài)學(xué)檢測(cè)效果有時(shí)不如FFPE樣品精細(xì)、(例如用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)時(shí));某些病理組織內(nèi)的一些感染性因子凍存后仍然保持活性，處理這些樣品時(shí)需要格外注意;組織樣品中的RNA在-80℃ 凍存時(shí)仍然不是長(zhǎng)期穩(wěn)定的，有人觀察到5年后RNA出現(xiàn)降解;核酸、蛋白質(zhì)等大分子經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融，有可能斷裂成較小片段;凍存耗能較多，需要較多專(zhuān)門(mén)的空間，成本高昂;當(dāng)凍存設(shè)備發(fā)生故障時(shí)，大批珍貴的樣品有可能被破壞，從而導(dǎo)致巨大的損失;當(dāng)用液氮凍存樣品時(shí)，還要防范凍傷、液氮容器爆炸及因空間密閉等導(dǎo)致窒息等風(fēng)險(xiǎn)。

　　3. 凍存溫度的選擇

　　前已述及，根據(jù)一般的物理化學(xué)規(guī)律，溫度越低，樣品的穩(wěn)定時(shí)間越長(zhǎng)。在超低溫冰箱面世之前，-20℃ 冰箱是常用的低溫貯存工具之一。實(shí)踐證明，-20℃ 時(shí)組織內(nèi)的大分子仍然可以被降解。而且，0至-60℃ 是水的結(jié)晶溫度。結(jié)晶容易對(duì)細(xì)胞和組織的微觀結(jié)構(gòu)造成傷害，一般不在這一溫度范圍來(lái)保存組織和細(xì)胞。一些經(jīng)過(guò)提純的大分子可以在這一溫度范圍內(nèi)短期保存。目前，大多數(shù)生物和醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)用-80℃ 冰箱或液氮凍存生物樣品。-80℃低于危害性較大的結(jié)晶溫度范圍，也是常用設(shè)備超低溫冰箱能達(dá)到的溫度。但在-80℃溫度下，不同的生物樣品的保存時(shí)間是不一致的。組織中的DNA可以在-80℃下可以保持?jǐn)?shù)年或更長(zhǎng)時(shí)間。組織中的RNA在-80℃下的穩(wěn)定性隨不同組織或細(xì)胞而異，但一般不超過(guò)5年。一些組織內(nèi)的RNA在-80℃下不到一年就發(fā)生了降解。為了長(zhǎng)期保存組織內(nèi)的RNA，可以將組織切成尺寸小于0.5cm 的小塊，沒(méi)入5-10倍體積的RNAsafety?等組織培養(yǎng)液中，置于凍存管內(nèi)，冰凍保存。RNAsafety?溶液能夠較好地維持RNA的完整性。甚至那些已知RNA酶含量較高的組織中的RNA也可以在RNAsafety?保存液中得以長(zhǎng)期凍存。

　　解凍方式選擇?

　　37℃水浴解凍?(推薦快速?gòu)?fù)蘇場(chǎng)景)

　　適用樣本?：細(xì)胞凍存液、大多數(shù)生物試劑(如酶、抗體)?。

　　操作要點(diǎn)?：

　　凍存管需擰松管蓋防爆裂，輕柔晃動(dòng)至僅剩小塊冰塊時(shí)取出?;

　　全程控制在1-2分鐘內(nèi)，避免長(zhǎng)時(shí)間高溫暴露?。

　　室溫解凍?(限部分穩(wěn)定試劑)

　　僅適用于耐溫性強(qiáng)的試劑(如某些緩沖液)，需邊觀察邊溶解，避免升溫?。

　　4℃冷藏/冰浴解凍?(推薦敏感樣本)

　　適用樣本?：外泌體、胎牛血清(FBS)、易沉淀蛋白?;

　　優(yōu)點(diǎn)：減少熱應(yīng)激損傷，但耗時(shí)較長(zhǎng)(需數(shù)小時(shí)至過(guò)夜)?。

　　隨著制冷技術(shù)的進(jìn)步，深低溫冰箱已經(jīng)出現(xiàn)在某些實(shí)驗(yàn)室。這類(lèi)冰箱制冷溫度可達(dá)到-150℃。它不需要像液氮罐那樣需要頻繁監(jiān)控液氮消耗情況。箱內(nèi)溫度也比較均勻恒定，但深低溫冰箱降溫速度低于液氮，一旦開(kāi)啟取放樣品時(shí)容易造成較大范圍的溫度波動(dòng)，溫度恢復(fù)時(shí)間也相對(duì)較長(zhǎng)。另外深低溫冰箱能耗很大，且必須保障供電。

　　注意事項(xiàng)?

　　避免反復(fù)凍融?：解凍后需分裝使用，尤其是酶類(lèi)、細(xì)胞樣本?;

　　特殊樣本處理?：

　　胎牛血清(FBS)禁用37℃水浴，易導(dǎo)致蛋白沉淀?;

　　含NaN3的試劑需透析去除，否則抑制HRP活性?;

　　安全防護(hù)?：操作液氮凍存樣本時(shí)需戴護(hù)目鏡，防凍傷或管體炸裂?。

　　三、替代方案?

　　無(wú)水復(fù)蘇儀?：干式加熱(37℃恒溫)，避免水浴污染，適用于無(wú)菌要求高的場(chǎng)景?;

　　梯度解凍?：對(duì)復(fù)雜樣本(如組織塊)可先4℃平衡，再37℃快速終融?。

　　注：以上資料僅供參考，如需具體的完整說(shuō)明，可參考品牌供應(yīng)商或咨詢(xún)技術(shù)老師。

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